Microscopia confocale

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Davanti all’iride, subito sotto al film lacrimale (vedi anche il quaderno L’occhio secco), la cornea è la prima lente biologica dell’occhio (Figura 1), una sottile e delicata membrana trasparente, priva di sangue. Ha la funzione di far convergere le radiazioni luminose sul cristallino e successivamente sulla retina. E’ fatta a strati. Quello più superficiale, l’epitelio, è una specie di pellicina di 5-7 livelli accatastati di cellule, che contiene il plesso nervoso dello strato basale. Subito sotto la membrana di Bowman, priva di cellule, sta il plesso nervoso sub-epiteliale e lo stroma che, costituito da fasci di fibre collagene, a loro volta organizzate in lamelle più o meno coese e interconnesse a seconda della profondità, tra loro ortogonali, cellule (cheratociti) e sostanza amorfa intercellulare, rappresenta circa il 90% del tessuto. La membrana di Descemet lo separa dall’endotelio, lo strato interno costituito da un monostrato di cellule cuboidi, di aspetto a mosaico, regolarmente esagonali (figua 2). Alla nascita sono numerose (circa 4.000 per millimetro quadrato), tendono a declinare fisiologicamente (se ne perdono circa 200, lo 0.5%, all’anno). La microscopia confocale visualizza in vivo l’anatomia della cornea a livello cellulare, la sua trasparenza, i suoi spessori con una tecnica precisa, veloce e indolore (buona parte delle acquisizione non necessita di contatto con la superficie corneale) da parte di uno strumento compatto e maneggevole (Figura 3). Strato per strato, le informazioni relative alle alterazioni corneali equivalgono a quelle ottenibili con gli esami citologico ed istologico. In poche parole, si tratta di uno strumento insostituibile per tutte le procedure, di diagnosi o chirurgia, che coinvolgono la cornea, a partire dal monitoraggio di sicurezza nei portatori di lenti a contatto e in chi soffre di occhio secco, per finire alle distrofie, alle degenerazioni, alle infezioni e alle chirurgie corneali (rifrattiva con laser ad eccimeri, trapianti, cross linking…).

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Figura 2. Vetrino istologico (a) di una cornea normale, spessa poco più di mezzo millimetro (530 micron) al centro. Dall’alto verso il basso s’incontrano lo strato superficiale (epitelio), la membrana di Bowmann, lo stroma, la membrana di Descemet e l’endotelio. Le immagini della microscopia confocale mostrano i dettagli dell’epitelio (prime 4 in alto di b) il cui spessore è pari a circa 55 micron, il plesso nervoso sub epiteliale (prima a sinistra in basso di b), lo stroma superficiale, più densamente popolato di cheratociti (seconda a sinistra in basso di b) e profondo (terza a sinistra in basso di b) e il mosaico endoteliale (prima a destra in basso di c)

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Figura 3. Il Confoscan® 3 di Nidek (a). Immagini ad alto ingrandimento di endotelio (b), stroma profondo (c), medio (d) e anteriore (e) e film lacrimale (f)

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Figura 4. Tipiche alterazioni filamentose intrastromali da miceti (Fusarium) (a) e microcistiche da Acanthamoeba (b) evidenziate al confocale

Per andare agli esempi concreti di applicazioni cliniche:
lo studio del film lacrimale nelle ipolacrimie (occhio secco) è particolarmente qualitativo con questa tecnologia, con cui monitoriamo la gravità della condizione e l’efficacia dei rimedi (Figura 3f);nelle infezioni corneali, il confocale vede le tipiche alterazioni (microcisti, filamenti…) all’interno dello stroma anteriore e l’attivazione dei cheratociti (Figura 4), nelle infezioni da funghi o protozoi come il Fusarium e l’Acanthamoeba, tipicamente epidemiche nei portatori di lenti a contatto, a causa di contaminazioni dei liquidi di manutenzione. Consente quindi la diagnosi differenziale precoce, evitando il ricorso alle indagini citologiche con prelievo, accelerando i tempi e migliorando la prognosi;nelle distrofie e nelle degenerazioni corneali, identifica le tipologie (iperplasia della membrana basale, map-dot-fingerprint disorder, granulare, a palizzata, di Fuchs….). Nella frequente distrofia endoteliale di Fuchs (Figura 5), le lesioni tipiche sono date da piccole zone scure, corrispondenti ad escrescenze della membrane di Descemet (A) attraverso zone di assenza di cellule (guttae, B) e granuli di pigmento retro corneale (C). Il mancato riconoscimento della condizioni può provocare un risultato disastroso dopo un apparentemente semplice intervento di estrazione di cataratta.

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Figura 5 (vedi testo)

Valutazione della risposta immunitaria nei trapianti corneali. L’osservazione periodica del grado d’infiltrazione cellulare, sopra tutto a carico del limbus corneale, consente un monitoraggio perfetto della fase immunitaria conseguente ai diversi tipi di trapainto corneale (perforante, lamellare, DSAEK…) (Figura 6);

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Figura 6. Risposta immunitaria cellulo-mediata (infiltrazione cellulare) a carico del limbus corneale dopo trapianto di cornea

nelle complicanze della chirurgia rifrattiva con laser ad eccimeri (PRK, LASIK), del cross linking corneale per il cheratocono, delle lenti a contatto, dell’ortocheratologia, della cataratta, del glaucoma, dei trapianti di cornea, una diagnosi completa è impossibile senza l’imaging del confocale;Lo studio quali-quantitativo dello strato endoteliale e’ un parametro di benessere oculare ormai entrato a pieno diritto in una completa e moderna visita oculistica. La forma, le dimensioni e il numero di queste cellule ci forniscono la storia della “salute” di questa porzione dell’occhio ed e’ di fondamentale importanza per la programmazione di tutti gli interventi sul segmento anteriore, compresi quelli di “routine” come le estrazioni di cataratta (Figura 7).

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Figura 7. Due esempi di conta delle cellule endoteliali con analisi morfometrica in un caso normale prima di un intervento di estrazione di cataratta